體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗常見問題與解答
—熱點問題—
第一題 細胞被“黑膠蟲"污染了該如何處理?
如果培養的細胞被“黑膠蟲"污染,需先去評估污染的嚴重程度。如果污染不嚴重,可選用市售的“黑膠蟲"清除試劑進行處理;如果污染較嚴重,建議直接丟棄該細胞,分析造成“黑膠蟲"污染的原因并進行治理。
第二題 CHL細胞為試驗系統,細胞準備時推薦的接種密度是多大?接種后培養多久可以開始染毒?
本公司使用T25瓶進行試驗,接種密度為6~9×10^4/mL,接種量為5mL,即每瓶細胞量是3×10^5個~4.5×10^5個。一般情況下,接種后24h左右細胞的融合率可達到80%即可進行染毒,如果融合率不夠,也可以繼續培養直至滿足試驗需求。
第三題 一般如何確定秋水仙素的濃度和處理時間???
秋水仙素劑量大,則作用時間短;秋水仙素劑量小,則適當延長作用時間。本公司使用的秋水仙素濃度是1μg/mL,4h。
第四題 秋水仙素工作的機理是什么?
秋水仙素可以抑制紡錘體的形成,導致紡錘絲無法捕捉到著絲粒而造成染色體不能向細胞兩極移動。同時,秋水仙素處理后,染色體將會不能排列在赤道板,所以在細胞中會散亂分布。
第五題 細胞收集量少是什么原因導致的?如何優化?
細胞收集量少的原因主要有以下幾點:
(1)酶消化過程消化不干凈;
(2)離心速度過低,細胞不能沉淀,導致細胞丟失;
(3)鋪板細胞量不夠;
(4)樣品對細胞有毒性,細胞死亡。
優化策略:
(1)酶消化過程需于顯微鏡下觀察,確保消化完;
(2)適宜的離心條件,通常250g,5min;
(3)細胞懸液需混合均勻,必要時多次計數;
(4)如有需求,請于正式試驗前開展預試驗。
第六題 低滲目的是什么?有什么注意事項?
在低滲環境中,細胞易吸水膨脹,染色體鋪展,以便能在一個平面上觀察所有染色體形態,為后續染色做準備。在低滲過程中我們需要注意以下幾點:
(1)低滲時間。低滲時間過長,可引起細胞破裂,染色體丟失;低滲時間不足,細胞膨脹度不夠,染色體聚集,分散不好,不利于閱片。本公司低滲是使用0.075mol/L的氯化甲溶液37℃水浴30~40min。
(2) 細胞操作需輕柔。低滲后的細胞會脹大,通透性增強,細胞操作過程一定要輕柔,以防細胞破裂。
(3)離心條件需適合。低滲后細胞膨脹,離心力過高,細胞容易破裂,導致染色體丟失;離心力過低,細胞不能沉淀,收集不到細胞。
第七題 細胞在固定過程中丟失是什么原因導致的?
細胞在固定過程中丟失可能是因為離心速度過低,細胞不能沉淀或沉淀不夠,在更換固定液的過程中導致細胞丟失。
第八題 每次固定的時間是多久?固定幾次比較合適?
本公司使用的是預固定加重復固定的方法。預固定在低滲結束前進行,一般3~5min,步驟雖簡單卻不能省略,可有效預防細胞因加入大量的固定液而凝結成塊。固定步驟共重復3次,一般30±5min。
第九題 玻片干燥怎么操作?
可于室溫下自然干燥,也可于37℃干燥箱中烘干。
第十題 使用吉姆薩染液同樣條件下染片,為什么會出現有的片子是藍色的,有的是紅色的?
根本原因是因為染色過程中pH的變化。吉姆薩染液由天青,伊紅組成,所帶電荷隨溶液PH而定。在偏酸性環境中下在電荷增多易與伊紅結合染色偏紅;在偏堿性環境中負電荷增多,易與美藍或天青結合,染色偏藍。
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